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天然细胞外基质（ECM）是粘弹性的并表现出应力松弛，而用于合成3D培养所需ECMs的水凝胶通常是弹性的。美国研究人员OvijitChaudhuri等通过材料学方法，独立于水凝胶的初始弹性模量、降解和细胞粘附配体密度，单独调节了3D培养所用水凝胶的应力松弛速率。发现培养于较快松弛速率水凝胶中的细胞铺展、增殖和间充质干细胞（MSCs）成骨分化均得到增强。其中在初始弹性模量17kPa的快速松弛水凝胶中，MSC会形成类似于骨的矿化、富含胶原蛋白1的基质。此外研究还发现应力松弛的作用由粘附配体结合、actomyosin收缩性和粘附配体的机械聚集介导。研究成果强调了应力松弛的重要性，它是细胞-胞外基质相互作用的一个关键特征，也是细胞培养生物材料的一个重要设计参数。文章以“Hydrogelswithtunablestressrelaxationregulatestemcellfateandactivity”为题发表于NatureMaterials。
背景
由聚乙二醇（PEG）、藻酸盐和透明质酸等聚合物的交联网络构成的水凝胶，常通过共价偶联到整合素结合配体（如RGD）用于3D细胞培养，或作为装载细胞的生物材料埋植剂来促进组织再生。相较于胶原、纤维蛋白等，这些水凝胶可实现独立控制理化性质（如基质弹性、配体密度、孔隙度），以及在微尺度上的均匀性，因此常作为使用首选。然而除非水凝胶可随时间降解，否则包括形状变化、迁移和增殖在内的一些正常细胞过程，在这些水凝胶中会受到抑制。虽然不可降解水凝胶可捕捉生理性ECM的一些特征，但通常几乎是完全弹性的。相比之下重构的细胞外基质（如胶原或纤维蛋白）和各种组织（如大脑、肝脏、脂肪组织、凝固的骨髓、初期骨折血肿或再生骨的软骨痂）都是粘弹性的，并且在施加15%的恒定应变时表现出部分应力松弛（图1a）。细胞在2D培养中一般产3-4%的应力，在3D培养中产生20-30%的应力。此外应力松弛试验中测得的峰值应力范围为-0Pa，完全在3D培养中细胞产生的应力范围内。已知材料的机械特性可以调节粘附细胞的行为，基质储存（纯弹性）或消散（粘弹性）细胞力的能力强烈暗示细胞与之有相互作用。有研究发现，在使用水凝胶作为细胞培养基质的情况下，改变基质粘弹性（与基质硬度无关）会对各种细胞行为产生影响。在表现出应力松弛的凝胶中，细胞随时间施加到基质上的每一个力或应变最初都受到一定的硬度抵抗，该硬度由初始弹性模量定义，随后随着时间的推移阻力减小。对于由弱交联形成的水凝胶，松弛部分源于交联的解结合及水凝胶流动，因此细胞力可以机械地重塑基质。本文研究了水凝胶粘弹性和应力松弛对3D培养中细胞铺展、增殖和MSC分化的影响。
结果
01-具有可调应力松弛的水凝胶
选择多糖藻酸盐（alginate）进行水凝胶纳米级结构调整研究，以开发一组应力松弛速率广泛但具有相似初始弹性模量的材料。虽然改变交联化学物质或聚合物浓度也可以改变水凝胶的应力松弛特性，但研究人员开发了一种材料学方法，可控制具有单一交联剂类型和相同藻酸盐浓度的水凝胶的应力松弛速率。假设通过使用不同分子量的聚合物与不同交联密度的钙（与藻酸盐离子交联）结合，由于网络中连接性和链移动性的改变，可以调节所得水凝胶的应力松弛性质（图1b）。由聚合物分子量降低引起的初始弹性模量的任何相关降低都可以通过增加交联来补偿。此外，假设短PEGspacer与藻酸盐的共价偶联将为藻酸盐链的交联提供空间位阻，并增强凝胶中的应力松弛（图1b）。这两种方法都会改变单个聚合物链之间的净亲和力，从而有望控制松弛行为。因此研究人员通过将藻酸盐的分子量从kDa降低到35kDa，并且进一步将5kDa的PEGspacer偶联到35kDa藻酸盐，证实应力松弛的速率显著提高（图1c）。具体而言，将材料的初始应力松弛至其一半的时间（τ1/2）从约1h调整至约1min，同时藻酸盐聚合物浓度和初始凝胶弹性模量保持恒定（图1c-e）。这些时间范围与各种组织中测量的范围类似（图1a），且可与细胞行为时间相关联。这些材料的应力松弛行为遵循双元素Maxwell-Weichert线性粘弹性模型。测量凝胶的频率相关流变特性，发现随着频率降低，剪切储能模量的降低速率更大，应力松弛速率的增加与之相关。共聚焦荧光显微镜证实凝胶在微米尺度上是均匀的。另外在组织培养条件下，这些凝胶的机械性能和凝胶的干聚合物质量在至少7天内都是稳定的（图1f，g）。因此在这个时间尺度上，基质的降解可以忽略不计。综上所述，该方法可以单独控制基质应力松弛的，与初始弹性模量和聚合物浓度无关，并且没有水凝胶降解。
图1调整藻酸盐水凝胶的纳米级结构，以独立于初始弹性模量和基质降解调节应力松弛特性，从而获得粘弹性行为。（a）交联水凝胶（聚丙烯酰胺）、胶原凝胶、骨折血肿（人）和各种组织（大鼠）的应力松弛试验。（b）降低钙（红色）交联的藻酸盐聚合物（蓝色）的分子量如何降低网络的纠缠与连接性（橙色箭头），以及小spacer的耦合如何提供交联区的空间间隔。（c）不同分子量藻酸盐或与PEGspacer偶联的低分子量藻酸盐组成的凝胶的应力松弛试验。（d）c中的τ1/2。应力松弛的时间随结构的改变而显著降低。（e）c中凝胶的初始模量测量。弹性模量间的差异不显著。（f）培养1天或7天后藻酸盐水凝胶的初始弹性模量。（g）培养1天或7天后藻酸盐水凝胶的干质量。
02-应力松弛影响细胞铺展和增殖
用以上研究了3D培养中基质应力松弛速率对细胞铺展和增殖的影响。3T3成纤维细胞封装于RGD偶联的藻酸盐水凝胶中，水凝胶具有不同的应力松弛速率，但初始弹性模量均约9kPa（图2a）。在应力松弛时间较长（τ1/2约1h）的材料中，细胞铺展和增殖都受到抑制，且观察到不可降解弹性水凝胶中典型的圆形细胞形态。随着应力松弛加快，细胞铺展和增殖都随之增加（图2b，c）。当RGD细胞粘附配体密度在松弛较快的凝胶中增加时，基质应力松弛对细胞铺展和增殖的影响增强，表明应力松弛的作用是通过基于整合素的粘附介导的（图2d）。由于初始弹性模量和藻酸盐浓度恒定，并且RGD细胞粘附配体密度也保持恒定在0、或1,μm，因此细胞铺展和增殖的增强仅归因于应力松弛的改变。在快速松弛水凝胶中观察到细胞形状的显著变化表明，细胞对水凝胶进行了机械重塑，由于水凝胶孔为纳米级且不可降解，因此细胞形状的变化和增殖必须通过基质移动来实现。
图2凝胶包裹的成纤维细胞中，铺展和增殖随着应力松弛的加快而提高。（a）包裹在藻酸盐凝胶中的3T3细胞。绿色为actin，蓝色为细胞核。于培养7天后拍摄。（b）包含单个3T3细胞的最小边界框的最长尺寸的量化。细胞铺展随应力松弛加快而显著增加。（c）增殖细胞定量。增殖随应力松弛加快而增加。（d）在松弛时间为70或s的藻酸盐凝胶中，量化包含单个3T3细胞的最小边界框的最长尺寸，作为RGD密度的函数。细胞铺展随两种凝胶中RGD浓度增加而显著增加。
03-基质应力松弛调节MSC分化
接下来观察基质应力松弛对3D培养中小鼠间充质干细胞系（D1,MSC）分化的影响。已知封装在离子交联藻酸盐水凝胶中的D1MSC和原代人MSC，在1-10kPa初始模量下主要向成脂分化，在11-30kPa初始模量下主要向成骨分化。假设在初始弹性模量为11-30kPa的基质中，MSC的成骨分化将随着凝胶中松弛的加快而减少。为了测试是否是这种情况，将MSC封装在具有不同应力松弛时间和初始弹性模量的藻酸盐水凝胶中（图3a、b）。当基质的初始弹性模量为约9kPa时，MSC主要表现出成脂分化（中性脂质染色），以及非常低水平的成骨分化（ALP染色和ALP活性定量分析），所有应力松弛时间都是如此（图3a，b），而在松弛时间约1min的快速松弛凝胶中，发现脂肪生成水平降低。相反，在约17kPa的较高初始弹性模量时，没有观察到成脂分化，并且在应力松弛较快的凝胶中成骨分化显著增强（图3a，b）。似乎细胞只是简单地随着时间的推移整合基质的弹性模量，随着应力松弛更快，成骨减少，成脂增加。更快的应力松弛也促进了MSC更大程度的铺展。尽管细胞初始接种密度保持不变，但7天后较硬凝胶中的细胞密度似乎更高，这可能是由于成脂细胞和成骨分化细胞之间的增殖差异。此外在弹性模量9kPa（成脂）和17kPa（成骨）的缓慢松弛凝胶（如τ1/2为2,s）中，MSC间的细胞形态相似；在应力松弛时间2,s和s，17kPa水凝胶中（成骨显著增加），MSC的细胞形态也相似（图3）。因此MSC的命运与细胞的形状是分离的，这与以前关于MSC在3D培养中分化的发现一致。
除表征MSC的分化，还检测了成骨分化干细胞的功能活性。已知在缓慢松弛的藻酸盐凝胶、PEG凝胶、可降解的透明质酸凝胶，或触变性PEG硅胶的3D基质中，MSC向成骨分化。然而尚无研究发现这些分化的细胞形成相互连接的、矿化的和富含Ⅰ型胶原的基质（骨的三个关键结构特征）。本研究利用VonKossa染色、免疫组化和能量色散x光光谱（EDS）显示，应力松弛较快条件下培养14天后，基质矿化和Ⅰ型胶原沉积都得到增强（图3c、d）。在应力松弛时间约1min的快速松弛凝胶中，MSC形成相互连接的骨样基质，该应力松弛时间接近早期骨折血肿的时间（图1a）。这一结果表明，快速松弛凝胶不仅能促进最大限度的成骨，还能使成骨分化的干细胞具有成骨活性。
图3MSCs向成骨分化并仅在快速松弛凝胶中形成相互连接的富含矿化Ⅰ型胶原的基质。（a）油红O（ORO）染色冷冻切片，（红色）表示成脂分化，ALP染色（蓝色）表示早期成骨分化。（b）ORO染色阳性细胞百分比定量，细胞裂解物中ALP活性定量。随着应力松弛的加快，成骨分化显著增加。（c）培养2周后凝胶冷冻切片上VonKossa（矿化）和Ⅰ型胶原染色。（d）培养2周后，凝胶切片的扫描电子显微和SEM-EDS图像。磷元素图（红色）覆盖在相应的反向散射SEM图像上。
在发现初始弹性模量和应力松弛率对MSC分化和骨形成活性的强烈影响后，研究了快速应力松弛促进这些行为的潜在机制。鉴于细胞通过与胞外基质配体的结合来感知胞外基质中的机械信号，因此首先检查了RGD密度对MSC分化的影响（图4a）。在μm的较低RGD密度下，在初始弹性模量17kPa的水凝胶中观察到应力松弛更快，成骨增强趋势更强，但成骨分化的程度相对于较高RGD密度显著降低（图4a）。表明应力松弛对成骨分化的影响是通过胞外基质配体介导的。细胞通过整合素受体与细胞外基质配体结合。使用识别抗体显示在松弛更快的凝胶中，β1整联蛋白向细胞外周的定位增加（图4b）。但没有观察到桩蛋白paxillin在细胞周围的定位，这表明在这种3D材料系统中，任何应力松弛水平下都没有形成常规的局部粘连。已知配体聚集与成骨分化相关，使用基于荧光共振能量转移（FRET）的技术评估RGD配体聚集。在包裹了细胞的快和慢松弛凝胶中，共聚焦显微镜分析偶联到藻酸盐上的荧光素-RGD和TAMRA-RGD间的FRET（图4c，d）。在培养18h后，松弛较快凝胶中与MSC相邻的水凝胶区域检测到的能量转移，相较松弛较慢凝胶程度更高（图4e）。在快速松弛凝胶中，细胞周围整个区域的FRET一般都是增强的。由于FRET信号可灵敏反应供体和受体荧光团之间的距离，证明了RGD配体的聚集，以及在松弛更快、初始弹性模量17kPa的水凝胶中，细胞对水凝胶的局部机械重塑。尽管在松弛更快、初始弹性模量9kPa的凝胶中，观察到类似的RGD配体聚集增趋势，但转移程度显著低于更硬的快速松弛凝胶。
由于整合素的结合和聚集激活了信号通路，研究人员探究了不同应力松弛水平的凝胶中，信号通路在介导成骨中的作用。已知细胞通过肌动球蛋白收缩（通常激活Rho信号通路介导）感知胞外基质的硬度，并通过激活Rac信号通路感知2D丙烯酰胺基质的损失模量。对包裹于初始弹性模量17kPa水凝胶中的MSC，通过药理学抑制myosin、Rho和Rac1。ML-7对myosin轻链激酶的抑制使成骨作用减少，表明快速应力松弛基质中成骨作用的增强涉及myosin的收缩性（图4f）。Y-抑制Rho会促进成骨（图4g）。用NSC抑制Rac1对成骨没有显著影响（图4h）。
图4较硬水凝胶中，通过ECM配体密度、RGD配体聚集增加、myosin收缩性介导的MSC成骨分化。（a）包裹于水凝胶的MSC中ALP活性定量。（b）培养一周的MSC中，actin（绿色）、细胞核（蓝色）和β1整合素（红色）的免疫荧光染色。（c）RGD-荧光与RGD-罗丹明间的FRET分析。（d）培养18h后，不同应力松弛特性水凝胶中，MSCs周围水凝胶中的FRET受体信号（红色）和细胞核（DAPI/蓝色）的共焦显微镜图像。空白点表示细胞的位置。（e）细胞边界2-3μm范围内，定量FRET受体信号的增强。（f）ML-7（myosin轻链激酶抑制剂）存在时MSC的ALP活性。（g）Y-（Rho激酶抑制剂）存在下，MSC的ALP活性。（h）NSC（Rac1抑制剂）存在下，MSC的ALP活性。
接下来检查了YAP转录调节因子的核定位。YAP转录调节因子被认为是细胞机械或几何应答中，控制细胞基因表达的关键调节元件。已知2D丙烯酰胺基质上培养的MSC在基质硬度改变时，YAP的核定位可指导MSC分化为成脂或成骨细胞。研究发现随着应力松弛更快，YAP的核易位增加，表明基质应力松弛对转录因子活性有影响。不同弹性模量间核YAP的水平变化的范围相同（图5a，b）。由于成脂分化主要在弹性模量约9kPa的基质中观察到，成骨分化主要在弹性模量约17kPa的基质中观察到，证明YAP的核易位与MSC命运无关（图5c，d）。表明在3D培养的MSC中，YAP的定位本身并不能控制细胞分化。
图5YAP核定位可通过较快的应力松弛得到增强，但与MSC命运无关。（a）培养一周的MSC中，免疫荧光染色actin（绿色）、细胞核（蓝色）和YAP（红色）。（b）核YAP与细胞骨架YAP浓度的定量比率。核YAP随着更快的应力松弛而显著增加。（c）量化ORO染色阳性的D1细胞百分比，作为相对核YAP的函数。（d）量化分化的D1细胞中ALP，作为相对核YAP的函数。
结论
本研究展示了一种调节藻酸盐水凝胶应力松弛性质的方法，并指出基质应力松弛对细胞生物学有深刻影响。强调了将基质应力松弛视为理解细胞-胞外基质相互作用、机械转导基础生物物理学的基本信号是非常重要的，因为大多数生理性的细胞外基质都表现出一定程度的应力松弛。在组织工程应用中，应力松弛可作为一个材料设计参数，特别是调节细胞增殖和促进骨再生方面。
参考文献：
Chaudhuri,O.,etal."Hydrogelswithtunablestressrelaxationregulatestemcellfateandactivity."NatureMaterials15.3():-.
