年4月18日/医麦客新闻eMedClubNews/--外泌体(Exosome)是一种可以由多种细胞及体液分泌的含有miRNA、mRNA、蛋白质等的囊泡体，直径在30-nm以内。既有来源细胞的特征，又有纳米级的直径，这使得外泌体极易穿过微小血管和各种病理细胞膜，已分别在疾病诊断检测、治疗、药物递送等方面展现出巨大的应用潜力，并成为近年来新兴的热门研究赛道。

▲外泌体在肿瘤免疫中的功能

虽然外泌体有诸多开发潜力，但基于外泌体的临床应用依然发展缓慢。其中，有两个主要的技术障碍限制了外泌体的基础和应用研究。首先是外泌体的提取的标准化及外泌体的产率，二是如何有效区分外泌体从其他细胞外囊泡，特别是功能性囊泡。总之，外泌体的提取和纯化工艺的优化仍然是未来外泌体临床应用发展的关键。

▲外泌体提取纯化流程

外泌体分布在极其复杂的体液中，这使得高产量的外泌体分离具有挑战性，目前即使是处理能力较高的“金标准”也存在带给后续分析的明显缺点。

由于适合各种样品来源的单一方法不切实际，因此已努力利用外泌体的不同物理化学和生化特性。到目前为止，已经报道了六类外泌体分离策略，包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、基于电荷中和的聚合物沉淀法，尺寸排阻色谱仪法和微流体技术法，每种技术都有各自独特的优缺点。

超速离心法

超速离心法是公认的外泌体分离金标准方法，也是分离包括细菌、病毒、亚细胞结构等的常用方法。但尽管超速离心由于其高处理能力而成为外泌体分离的“黄金标准”，但通过这种方法制备的外泌体样品中的高水平蛋白质聚集体和脂蛋白污染极大地损害了它们的定量和功能分析。

超速离心的方法可分为密度梯度离心法和普通的差异超速离心法两大类。

差速超速离心法也称为简单超速离心或造粒法，是最常见的外泌体分离策略。过去30年来，差速超速离心法已被广泛用于从细胞培养基、血清、唾液、尿液和脑脊液等各种来源分离外泌体。其原理非常简单，在一定的离心力下，可以根据密度，大小和形状顺序分离流体样品的不同细胞外组分。年该方法首次用于从网织红细胞组织的培养基中分离外泌体。

年，该方法得到了进一步优化。研究人员根据测试样品的性质，可以首先进行清洁步骤，通过低速离心（例如，g/10min）消除大生物颗粒，然后用g/10min至10万g/10min的离心力进行多次离心循环，以依次去除污染物，例如细胞德比，凋亡体和蛋白质聚集体，以提高外泌体分离的纯化程度。

差速梯度离心法示意图

该种方法的优点在于：很容易扩大规模，可用于大规模的外泌体制备；易于使用，对技术专业知识的要求很少；以及无需复杂的样品预处理。

然而，由于细胞外液具有高异质性，在一定的离心力下，所有浮力密度、大小和质量达到一定阈值的组分，包括外泌体、微囊泡和非囊泡，如蛋白聚集体和脂蛋白，都可以在管的底部沉淀。因此，通过差异超速离心制备的外泌体样品通常纯度较低，这可能会影响许多下游应用，如外泌体相关功能分析。

密度梯度离心和速率梯度离心

密度梯度离心是由差速超速离心的低纯度问题应运而生的多种离心方法中，目前应用最广泛的分离纯化方法。典型的密度梯度超速离心包括以下步骤：首先，将覆盖样品中颗粒密度范围的具有不同密度（例如碘氧化或蔗糖）的生物相容性培养基层放入管中，密度从下到上逐渐降低。接下来，将感兴趣的样品加入到密度梯度培养基的顶部，并延长离心时间。最终，细胞外组分，包括外泌体，凋亡体和蛋白质聚集体，逐渐达到相同密度的层中的静态位置（等光位置）。

密度梯度离心法示意图

密度梯度超速离心能为下游应用提供更纯净的外泌体样品。因此，密度梯度超速离心近年来在外泌体分离方面的应用占比得到了十足的增长。

然而，这种常用的等离子超速离心完全取决于样品中不同溶质之间的密度差异。虽然该方法有效地将外泌体与蛋白质聚集体等常见污染物分离，但该方法无法分离出具有与外泌体相似（但大小不同）的细胞外囊泡（例如微囊泡）。为了有效地解决这一技术问题，研究使用了移动区密度梯度离心（也称为速率区域离心），通过大小和密度分离颗粒。

然而，与等离子超速离心不同，由于这种类型的超速离心中培养基的浓度低于所有样品组分的浓度，因此所有不溶性颗粒都可以在长时间离心后在管的底部沉淀（因此它被称为移动区离心）。因此，必须仔细确定离心时间，以获得最佳的外泌体分离。为了最大限度地减少外泌体沉淀，通常将高密度介质加载到离心管的底部以用作缓冲。

但超速离心确实有其缺点。例如，尽管梯度超速离心能够以最小的污染纯化外泌体，但该方法的处理量受到负载区下限的限制。此外，超速离心方法不仅需要昂贵的设备，还需要训练有素的技术人员，特别是对于梯度超速离心。同时，分离的外泌体的结构和生物学功能可能会受到长时间的超离心力的影响，不利于下游应用（例如基于外泌体的功能研究和药物开发）。超滤和尺寸排阻色谱法可以弥补此类问题。

超滤法

超滤可以使用具有不同MWCO（分子量截止值）的超细纳米过滤膜从临床样品或细胞培养基中分离细胞外囊泡，并通过大小区分外泌体和共囊泡。

与超速离心方法相比，基于超滤的外泌体分离大大缩短了处理时间，并且不需要特殊设备，为经典的超速离心策略提供了理想的替代品。重要的是，通过轻松调整滤光片大小，超滤允许研究人员对具有定义粒径的小细胞外囊泡（包括外泌体）的特定亚群进行分类。

目前已宥两种较为完善的超滤设备。第一种是串联配置的微滤器，它由两个串联配置的微滤器组成，具有约20-nm的尺寸排除限制[41]。当通过两个膜时，大囊泡包括凋亡体，以及大多数微囊泡被困在nm的膜中，而直径为20-nm的囊泡保留在底部，较小的颗粒（如蛋白质）通过则20nm微滤器。

顺序超滤是另一种流行的外泌体分离方法。细胞外液首先通过nm过滤器以除去大颗粒，包括细胞碎片，细胞和凋亡体。之后，滤液通过具有-kDMWCO的第二个过滤器以除去游离蛋白质和其他小颗粒。最后通过nm滤光片从滤液中收集直径在50-nm之间的外泌体。

A图为微滤器，B图为顺序超滤

由于效率高、设备成本低、操作快速、便携性良好、可达到中等纯度等优点，超滤越来越受欢迎。但在过滤过程中，其剪切应力会引起的潜在劣化；并且可能由于堵塞和膜捕获而造成原料的损失。

尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法（SEC）能够以最小的结构损伤分离外泌体。在过去的50年中，各种细小的多孔材料，如葡聚糖聚合物（Sephadex），琼脂糖（Sepharose）和聚丙烯酰胺（Sephacryl或BioGel）被运用到SEC的优化中。早在发现外泌体之前，SEC就已经得到很好的发展，并广泛应用于大分子或大分子聚集体（如蛋白质，聚合物和各种脂质体颗粒）的高分辨率分离。

基于尺寸排阻色谱的外泌体分离原理为：当溶液通过由多孔树脂颗粒组成的固定相时，分子可以根据尺寸分离;虽然流体动力学半径小于固定相孔隙的颗粒进入孔隙以延长交通距离，但不能进入孔隙的较大颗粒直接在树脂周围移动。这导致不同尺寸的颗粒表现出不同的保留时间，因此有助于基于尺寸的分离。

尺寸排阻色谱法示意图

SEC最特别的优点在于，该方法能够保存分离外泌体的天然生物活性。与超速离心和过滤不同，SEC通过被动重力流进行，这不会影响囊泡结构和完整性。通过选择具有生理渗透压和粘度（例如PBS）的洗脱缓冲液，可以进一步增强外泌体的自然状态。

除了维持外泌体功能外，SEC还有其他优点。首先，SEC所需原料量较小，可低至15μL；其次，无需额外预处理；第三，其操作时间可控，以节省人力物力成本；第四，与超滤法类似，微调所施用材料的孔径可以产生明确的细胞外囊泡亚群；第五，其溶质不与固定相相互作用，确保样品损失尽可能低，提高产量。

该方法不仅适用于处理痕量液体样品，而且易于扩展和自动化，用于高通量外泌体制备。但其大规模商业化生产的挑战在于，设备成本相对较高，并且需要额外的外泌体富集方法。

聚合物诱导沉淀法

聚合物诱导沉淀法是另一种常用的外泌体分离策略，高亲水性不含水的聚合物可以改变外泌体的溶解度。该方法类似于乙醇介导的核酸沉淀，高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，产生疏水性微环境，导致外泌体沉淀。在各种亲水性聚合物中，聚乙二醇（PEG）是一种描述良好的无毒聚合物（医药产品的常用赋形剂），具有重塑周围材料水溶性的能力，已被普遍使用，也是目前几种流行的商业外泌体分离试剂盒的基础。

现有的基于聚合物的外泌体沉淀方法通常采用分子量为至0Da的PEG。首先，需要进行预处理以除去大的污染物颗粒，例如细胞碎片和凋亡体，然后将预处理的样品与PEG溶液在4°C下孵育过夜。接下来，通过低速离心（0g/10min）收集沉淀的外泌体。

聚合物诱导沉淀法示意图

聚合物沉淀法的优势在于：易于使用、设备需求低、样品量兼容性高、效率高、可分离蛋白质聚集体、其他细胞外囊泡和聚合物污染物的污染物。但该方法所需的处理时间较长，需要复杂的清理步骤，会因此影响下游分析和定量的结果。

免疫亲和力捕获法

免疫亲和力捕获法能够分离高度纯化的外泌体，可用于原位检测。从理论上讲，任何仅或高度存在于外泌体膜上且在细胞外液中缺乏可溶解对应物的任何蛋白质或细胞膜组分都可用于基于免疫亲和力的外泌体捕获。在过去的几十年中，研究人员已经记录了各种外泌体标志物，包括溶酶体相关膜蛋白-2B、跨膜蛋白、热休克蛋白、血小板衍生生长因子受体、融合蛋白、脂质相关蛋白以及磷脂酶等。其中，Rab5、CD81、CD63、CD9、CD82、膜联蛋白和Alix等跨膜蛋白已被广泛用于商业化选择性外泌体分离。

为了有效地分离基于免疫亲和力的外泌体，需要将抗体固定在固体表面上以进行外泌体分离。其中，亚微米大小的磁性颗粒目前被广泛用于重组蛋白的免疫沉淀。

该方法不仅由于其较大的表面积和近乎均匀的工艺而达到较高的捕获效率和灵敏度，而且还可容纳较大的起始样品量，因此允许针对特定应用进行升级或缩小。此外，据报道，该方法可以通过检测分离的外泌体上的疾病特异性标志物（例如，用于癌细胞的EpCAM，CD，EGFR）直接转化为诊断平台，通过疾病特异性抗体和磁激活细胞分选促进。

免疫亲和力捕获法示意图

但必须考虑到的是，与该方法相关的非中性pH和非生理洗脱缓冲液（用于将外泌体与抗体分离）可能会不可逆地影响所收集的外泌体的生物学功能。因此，在实际操作中，必须继续优化外泌体标志物的选择，寻找对外泌体天然结构损伤更低的额外洗脱步骤。此外，该方法还存在产量较低、抗体基成本较高的问题，化学抗体或许是下一步的改进方向。同时，对于需要多个标志物阳性的总外泌体基团来说，该方法无法达到同时分离。

微流体技术

集成的微流体技术可在微观尺度上探索外泌体的物理化学和生化特征，有助于组合外泌体分离和分析。

在现有信号检测平台的推动下，这些小型化微流体装置不仅可以从指尖量的体液中快速分离出体外体，还可以进行实时外泌体表征以进行原位诊断。事实上，微流体技术通过将传统的两步程序（外泌体分离和表征）转移到集成的一步法中，正在极大地改变基于外泌体的诊断格局。

微流体技术示意图

微流体技术可分为：基于免疫亲和力的微流体分离技术、基于尺寸的微流体分离技术以及非接触式微流体。基于免疫亲和力的微流体目前能够进行高效和高特异性的外泌体分离，而基于尺寸的微流体分离则能提高其纯度。未来非接触式微流体或许是外泌体制备的多功能工具，有助于外泌体的实时分析。

基于尺寸的微流体分离技术示意图

非接触式微流体分离技术示意图

非接触式微流体可实现简化的外泌体分离过程。在基于粘弹性介质流动的微流体系统中，含外体的流体与鞘流从不同入口添加后相遇，并首先沿着微通道壁对齐。在施加由流体的粘弹性引起的弹性提升力后，外泌体和其他细胞外组分根据其大小被驱动向微通道的中心线，较大的颗粒最终到达中心线。在超声波的压力下，具有不同机械性能（例如，可压缩性，大小和密度）的颗粒经历差分辐射力，并导致以连续的方式进行无接触和尺寸依赖性的外泌体分离。

参考资料：

1.Progress,opportunity,andperspectiveonexosomeisolation-effortsforefficientexosome-basedtheranostics，Theranostics;10(8):-.doi:10.7/thno.

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