随着分子生物学技术的不断发展，10%中性福尔马林固定标本是可靠的分子生物学研究材料来源，在医学检验、法医鉴定、大宗病例回顾性研究等方面得到广泛应用。已有研究证明石蜡包埋组织在制作及保存过程中受多种试剂等因素的影响，导致DNA脆性增加、DNA与蛋白质交联等问题，为从中保质保量地提取DNA带来困难，提取结果经常是DNA片段短、产物少、抑制物多。

一、DNA与蛋白质交联

1.产生原因

在石蜡包埋组织制备的过程中，为了使石蜡更加牢固，并保持切片完整，实验中常常使用加热、紫外线辐射或化学处理等方法固定石蜡，从而导致了石蜡分子之间的交联。当发生交联时，组织石蜡切片中的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白质分子交联。

图1：石蜡包埋组织交联及解交联释放DNA的过程

想要提取完整的DNA分子，通常需要解交联（de-crosslinking）步骤。通过去除石蜡以及相关的交联剂残留物，解开交联的DNA、RNA和蛋白质，并去除RNA和蛋白质。进行组织消化后样品已经变成水化状态，释放DNA用于后续纯化。

2.解决方法

要解交联石蜡包埋的组织，可以尝试以下方法：

1)硫酸溶解：将石蜡包埋的组织切片放入2%至5%的硫酸溶液中浸泡数小时至过夜，硫酸能够解开石蜡与蛋白质之间的交联，使组织恢复可溶性。之后，用纯水或缓冲液洗涤切片，以去除残留的硫酸。

2)温度处理：高温也可以帮助解交联。将切片放入70°C至80°C的温水中浸泡一段时间，然后用纯水或缓冲液洗涤切片，以去除残留的石蜡。

图2：组织石蜡切片恒温水浴后，加入脱蜡剂后上层的蜡相

3)酶消化：某些酶可以分解蛋白质的交联结构，如蛋白酶K。将切片浸泡在含有适量酶的缓冲液中，按照酶的使用说明进行处理。处理后，用纯水或缓冲液洗涤切片，以去除残留的酶和石蜡。

三种解交联方法对比：

二、DNA脆性增加

1.产生原因

甲醛是福尔马林固定液中的主要成分，它在发挥固定组织作用的同时，也对DNA分子产生不利影响，甲醛会导致组织中蛋白和DNA的交联导致DNA链脆性增加，受机械剪切力作用后容易发生断裂。

图3：DNA损伤示意图

2.解决方法

1)提取DNA过程中应尽量减少酚/氯仿法繁杂的操作程序；

2)避免偏酸性的固定环境；

3)减少对DNA分子的额外损伤。

三、如何减少抑制物

1.产生原因

提取的DNA中存在着一些不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除的PCR反应抑制因子，如某些染色剂小分子对DNA聚合酶的抑制，DNA严重降解后出现的大量寡核苷酸碎片，去除RNA残留的RNase，以及脂质等杂质残留。

2.解决方法

为了克服这些抑制物的影响，可以采取一些策略：

(1)蛋白酶处理：将组织样本用含有蛋白酶的缓冲液进行处理，以去除可能存在的蛋白质抑制因子。

(2)再沉淀：通过再次离心沉淀，将抑制物沉淀到底部，从而使DNA上清液中的抑制物浓度降低。可在DNA洗涤步骤中添加盐和乙醇等物质来增加抑制物的沉淀效果。

(3)稀释：如果初始提取的DNA含有高浓度的抑制物，可以尝试对DNA溶液进行合适的稀释，从而降低抑制物的浓度。

(4)高温处理：高温可以通过破坏抑制物的结构来消除其对DNA的影响。可以将DNA溶液在适当的温度（例如95°C）下加热一段时间，然后快速冷却，以使抑制物失活。