具有优异的可打印性，高保真度和出色的细胞存活力的卓越生物墨水的开发仍然是生物3D打印的主要挑战。近期，中科院深圳先进院的阮长顺课题组在Biofabrication期刊上发表了“Temperature-programmableandenzymaticallysolidifiablegelatin-basedbioinksenablefacileextrusionbioprinting”的文章，通过使用可逆四氢键合的脲基-嘧啶酮（UPy）和酶反应性酪胺部分（Tyr）进行顺序化学修饰，使明胶具有可设定温度的粘度和酶控制的固化，从而实现了增强的可打印性和高保真性。

研究背景

新兴的生物打印技术可以精确地排列载有细胞的构建体，以模拟真实的人体组织，这在器官缺损的个体化治疗和药物筛查等方面展示了巨大的潜力。可用于挤出的生物墨水通常具有适当的粘度，以促进三维堆积并同时减少对细胞的损害。同时，还必须在温和的条件下使其立即固化，以确保高保真度。后固化后，打印的支架也应在生理环境中（例如37摄氏度易发生溶胀变形）保持较高的形状保真度，并提供合适的基质来支持负载细胞的生长和功能。尽管这些生物墨水特性很重要，但目前并没有一款完美的生物墨水提供全部相关的性能。

明胶由于其生物相容性，生物降解性和非免疫原性而成为理想的生物墨水。然而，其固有的低粘度和在生理条件下不稳定的物理特性使其不适用于单独使用打印具有高保真度的组织。在此，研究者通过使用可逆四氢键合的脲基-嘧啶酮（UPy）和酶反应性酪胺部分（Tyr）进行顺序化学修饰，使明胶具有可设定温度的粘度和酶控制的固化，从而实现了增强的可印刷性和高保真。

生物墨水设计与评价

UPy能够形成可逆的四氢键，从而在室温下具有出色的热响应性能和稳定性。如将UPy单元化学接枝到明胶的骨架上（称为Gel-UPy），得到具有可编程温度粘度的Gel-UPy生物墨水，这对生物打印过程很有帮助。另外，一些先前的研究报道酶促交联可以在温和的反应条件下实现且具有生物相容性，因此有利于在组织工程支架中使用，尤其是HRP/H2O2。因此，将Tyr部分进一步引入Gel-UPy主链（称为Gel-UPy-Tyr），应在温和条件下通过HRP/H2O2将其酶交联以立即固化。由于氢键和酶交联作用增强了分子间网络，生物打印的载有细胞的Gel-UPy-Tyr构建体应表现出高的形状保真度和机械稳定性。同时，在生理环境（37℃）下，Gel-UPy-Tyr的酶交联网络应提供连续的机械支持以保持形状保真度，同时应削弱包括分子间三重螺旋和氢键在内的可逆键合创造一个宽松舒适的微环境，以长期改善细胞生长和分化。

图1.墨水设计

为了比较明胶基墨水改性前后的力学性能，分别对明胶、Gel-UPy-0.和Gel-UPy-0.05进行了力学性能评价。结果表明，明胶在压缩条件下易碎，而Gel-UPy-0.05水凝胶能承受更大的压缩和拉伸性能。

图2墨水特性

Gel-UPy水凝胶具有粘弹性，相比明胶，Gel-UPy水凝胶的模量和延伸率显著提高，有利于细胞打印的形状保真度。

图3墨水的力学特性

墨水的打印性能

生物墨水的剪切变稀行为有利于材料成形和提高细胞存活率，且Gel-UPy-Tyr可在生理温度37℃下打印。Gel-UPy-Tyr的出丝宽度与针的直径尺寸高度相似，可在不断裂的情况下保持其形状。因此，该材料有构建复杂结构的能力。同时，在37℃细胞培养基浸泡2天后观察到打印的网状结构孔隙率保持良好，并保持良好的细胞存活率。酶交联后Gel-UPy-Tyr墨水中hBMSC的细胞存活率比光交联后GelMA墨水的细胞存活率高。通过7天培养实验发现，Gel-UPy-Tyr墨水能显著促进hBMSC的增殖和展开。

图4墨水的打印特性

图5墨水的生物相容性

组织结构

研究者进一步打印了一个可逆的，扭曲的，人类真实尺寸的，载有hBMSC的耳朵，一个包含hBMSC和内皮细胞的双细胞胫骨样构建体以及一个六边形棱形的载有肝细胞的支架，显示了该墨水在复杂组织样结构生物打印中的巨大潜力。该构建体中的细胞具有90％以上的细胞存活率，并在一周内显示出增殖和蛋白质分泌，这表明在生理温度下基于Gel-UPy-Tyr的构建体不仅可以保持高保真度，而且还可以支持加载的细胞的生长和功能。

图6组织结构打印能力

总结

研究者开发了一种新型的基于明胶的生物墨水，用于在细胞打印复杂的结构体。在明胶网络中引入具有四重氢键的UPy，赋予了生物油墨以可编程温度的粘度。因此，UPy修饰的明胶生物墨水可用于通过热辅助挤出生物打印来构建精确的结构。为了提高可打印性，增强形状保真度并保持较高的细胞活力，通过改变聚合物网络中UPy的含量，将明胶生物墨水的粘度调节至合适的水平，以便在生理温度下进行打印。生物打印后，在温和的条件下通过HRP/H2O2进行酶交联以化学固化充满细胞的复合结构，以进一步稳定结构并确保高形状保真度。基于研发的墨水，研究者成功创建了各种复杂的组织样结构，并显示出高细胞活力，良好的增殖和生物功能。这些明胶基生物墨水具有可设定温度的粘度和酶促固化有望实现功能性3D组织的构建，并最终形成器官，其未来用途包括从药物筛选到再生和个性化药物等方面。

参考文献

HuiminHe,DuoLi,ZifengLin,LiuqiPeng,JirongYang,MingmingWu,DelinCheng,HaoboPanandChangshunRuan*.Temperature-programmableandenzymaticallysolidifiablegelatin-basedbioinksenablefacileextrusionbioprinting.Biofabrication,12:.（

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